Manuel de Synthèse : Les Milieux de Culture en Microbiologie

Chapitre 1 : Milieux d’Isolement Non Sélectifs (Usuels)

Gélose Nutritive

C’est un milieu de base simple, non sélectif, qui permet la croissance des bactéries non exigeantes. Il est composé d’extraits de viande, de peptones, de chlorure de sodium et d’agar. Il ne contient ni inhibiteur ni indicateur, ce qui en fait un milieu d’isolement général destiné à la culture des germes à croissance rapide.

Notes de l’IA 🧑‍🏫 : La gélose nutritive standard contient généralement 5 g/L d’extrait de viande, 10 g/L de peptone, 5 g/L de NaCl et 15 g/L d’agar. Elle est dite « pauvre » car elle manque de facteurs de croissance spécifiques, ce qui limite son usage aux bactéries non exigeantes. Pour les germes plus exigeants, on préfère la gélose au sang.

Gélose au Sang

Ce milieu est préparé en ajoutant 5 % de sang (de mouton ou de cheval) à une base nutritive stérile. Il permet de cultiver les germes exigeants comme Streptococcus et Haemophilus. Sa grande valeur réside dans l’observation des types d’hémolyse :

• Hémolyse alpha (α) : hémolyse partielle, donnant une zone verdâtre autour des colonies (ex. Streptococcus pneumoniae).

• Hémolyse bêta (β) : hémolyse totale, zone claire et transparente (ex. Streptococcus pyogenes).

• Hémolyse gamma (γ) : absence d’hémolyse (ex. Enterococcus faecalis).

La gélose au sang cuit (dite « chocolat ») est chauffée à 80 °C, ce qui libère des facteurs de croissance (hémine, NAD) et permet la culture d’Haemophilus influenzae et de Neisseria.

Notes de l’IA 🧑‍🏫 : La distinction entre hémolyse α et β peut être subtile : l’hémolyse α résulte d’une oxydation de l’hémoglobine (verdâtre) tandis que la β est due à une lyse complète des globules rouges par des hémolysines. La gélose chocolat doit son nom à sa couleur brune après chauffage, non à sa composition particulière.

Points Clés à Retenir 📌

• La gélose nutritive est un milieu non sélectif de base.

• La gélose au sang permet la culture des germes exigeants et la lecture de l’hémolyse.

• La gélose chocolat est enrichie pour les bactéries nécessitant des facteurs de croissance libérés par le chauffage du sang.

Chapitre 2 : Milieux Sélectifs et Différentiels des Gram Négatifs (Bacilles)

Gélose Drigalski

Ce milieu sélectionne les bacilles Gram négatif grâce à des inhibiteurs (violet de cristal et sels biliaires). Il contient du lactose et un indicateur coloré, le bleu de bromothymol.

• Colonies jaunes : bactéries fermentant le lactose (production d’acide → virage de l’indicateur au jaune).

• Colonies bleues/vertes : bactéries ne fermentant pas le lactose (milieu alcalin → couleur inchangée).

Notes de l’IA 🧑‍🏫 : Le bleu de bromothymol vire du bleu (alcalin) au jaune (acide) pour un pH de 6 à 7,6. Les sels biliaires et le violet de cristal inhibent les Gram positif en perturbant leur membrane. La gélose Drigalski est moins utilisée que MacConkey dans les pays anglo-saxons, mais reste courante en France.

Gélose MacConkey

Très similaire à Drigalski, elle utilise les sels biliaires et le violet de cristal comme inhibiteurs, et le rouge neutre comme indicateur de pH.

• Colonies roses/rouges : fermentation du lactose (virage du rouge neutre).

• Colonies incolores : absence de fermentation du lactose.

Notes de l’IA 🧑‍🏫 : Le rouge neutre est rouge à pH < 6,8 et jaune à pH > 8. La gélose MacConkey existe aussi en version sans lactose (MacConkey sans sucre) pour différencier les entérobactéries non fermentantes. Elle est le milieu standard pour l’isolement des entérobactéries dans les laboratoires de microbiologie.

Gélose Hektoen

Ce milieu est très utilisé pour la recherche de Salmonella et Shigella dans les coprocultures. Il contient plusieurs sucres (lactose, saccharose, salicine) et un indicateur (bleu de bromothymol). De plus, il permet de détecter la production d’H₂S par les bactéries (colonies à centre noir, précipité de sulfure de fer).

• Colonies jaunes : fermentation d’un sucre.

• Colonies bleues/vertes : absence de fermentation.

• Centre noir : production d’H₂S (caractéristique de Salmonella).

Notes de l’IA 🧑‍🏫 : Le milieu Hektoen contient du thiosulfate de sodium comme source de soufre et du citrate de fer pour la détection de l’H₂S. Shigella ne produit pas d’H₂S et ne fermente ni lactose, ni saccharose, ni salicine (colonies vertes). Salmonella est souvent lactose-négative et H₂S-positive.

Points Clés à Retenir 📌

• Drigalski et MacConkey sélectionnent les Gram négatifs et différencient les lactose +/–.

• Hektoen permet en plus la détection de la production d’H₂S, utile pour différencier Salmonella.

• Les inhibiteurs (violet de cristal, sels biliaires) sont la base de la sélection.

Chapitre 3 : Milieux Sélectifs et Différentiels des Gram Positifs (Cocci)

Objectifs d’Apprentissage 🎯

• Expliquer la sélectivité des milieux à haute teneur en NaCl pour les staphylocoques.

• Différencier Staphylococcus aureus des autres staphylocoques sur gélose Chapman et Baird-Parker.

• Décrire les réactions biochimiques observées (fermentation du mannitol, réduction du tellurite, activité lécithinase).

Gélose Chapman (ou Mannitol Salt Agar)

Ce milieu est hautement sélectif pour les staphylocoques grâce à une forte concentration en chlorure de sodium (75 g/L, soit 7,5 %). Il contient du mannitol et un indicateur de pH (rouge de phénol).

• Colonies jaunes avec virage de la gélose au jaune : Staphylococcus aureus fermente le mannitol → acidification.

• Colonies roses (gélose reste rose) : staphylocoques à coagulase négative ne fermentant pas le mannitol (ex. S. epidermidis).

Notes de l’IA 🧑‍🏫 : La concentration en NaCl de 7,5 % inhibe la plupart des autres bactéries (entérobactéries, Pseudomonas, etc.) mais permet la croissance des staphylocoques qui sont halophiles. Le rouge de phénol vire du rouge (alcalin) au jaune (acide) entre pH 6,8 et 8,4.

Gélose de Baird-Parker

Milieu spécifique pour l’isolement et le dénombrement de Staphylococcus aureus. Il contient du pyruvate, du tellurite de potassium et du jaune d’œuf (source de lécithine).

• Colonies noires : réduction du tellurite en tellure métallique.

• Halo clair autour des colonies : activité lécithinase (dégradation de la lécithine du jaune d’œuf).

• Halo opaque : parfois absence d’halo clair lié à la lipase.

Notes de l’IA 🧑‍🏫 : Le milieu Baird-Parker est le milieu de référence pour la recherche de S. aureus dans les aliments (norme NF EN ISO 6888). La réduction du tellurite est caractéristique, mais d’autres staphylocoques (ex. S. saprophyticus) peuvent aussi donner des colonies noires. L’activité lécithinase (ou lécithovitelline) confirme l’identité.

Points Clés à Retenir 📌

• La gélose Chapman sélectionne les staphylocoques par forte salinité et différencie S. aureus par fermentation du mannitol.

• La gélose Baird-Parker utilise le tellurite et le jaune d’œuf pour identifier S. aureus.

• Ces milieux sont essentiels en diagnostic clinique et agroalimentaire.

Chapitre 4 : Géloses pour l’Identification et l’Orientation Spécifique

Gélose CLED (Cystine Lactose Electrolyte Deficient)

Ce milieu est principalement utilisé pour les examens cytobactériologiques des urines (ECBU). Il est déficient en électrolytes, ce qui empêche l’envahissement par les souches de Proteus (phénomène de swarming). Il contient du lactose et un indicateur (bleu de bromothymol).

• Colonies jaunes : lactose positif.

• Colonies bleues/vertes : lactose négatif.

Notes de l’IA 🧑‍🏫 : Le terme « déficient en électrolytes » signifie que la concentration en sels est faible (moins de 0,1 %), ce qui limite la mobilité de Proteus. Ce milieu permet de compter les colonies sans risque de fusion dues au swarming. Il n’est pas sélectif (aucun inhibiteur) et permet la croissance des Gram positif et négatif.

Géloses Chromogènes (ex. UriSelect, ChromID)

Ces géloses modernes contiennent des substrats enzymatiques incolores (chromogènes). Lorsque la bactérie possède une enzyme spécifique, elle clive le substrat et libère un chromophore, ce qui colore la colonie.

• E. coli : rose (β-glucuronidase).

• Entérocoques : bleu (β-glucosidase).

• Klebsiella/Enterobacter : vert/bleu (β-glucosidase).

• Proteus : brun (tryptophane désaminase).

Cela permet une identification immédiate, réduisant le temps de réponse et le nombre de tests secondaires.

Notes de l’IA 🧑‍🏫 : Le principe repose sur l’utilisation de liaisons chimiques instables entre un sucre ou un substrat et un chromophore (indoxyl, alizarine…). L’enzyme bactérienne hydrolyse la liaison, libérant un colorant visible. Certains milieux combinent plusieurs chromogènes pour détecter plusieurs enzymes à la fois. Ils sont très utilisés en routine pour les urines mais aussi pour les hémocultures.

Points Clés à Retenir 📌

• La gélose CLED évite le swarming de Proteus dans les ECBU.

• Les géloses chromogènes fournissent une identification rapide par coloration enzymatique directe.

• Ces milieux améliorent le délai et la précision du diagnostic microbiologique.

Chapitre 5 : Géloses d’Application Technique

Gélose Mueller-Hinton (MH)

C’est le milieu standard international obligatoire pour la réalisation des antibiogrammes par la méthode des disques (diffusion en milieu gélosé). Sa composition est normalisée (infusion de bœuf, peptone de caséine, amidon, agar) pour garantir une reproductibilité des zones d’inhibition.

• pH neutre (7,2–7,4).

• Faible teneur en thymine pour ne pas interférer avec les sulfamides.

• Permet la croissance de la plupart des bactéries aérobies.

Notes de l’IA 🧑‍🏫 : La méthode de diffusion en gélose MH est décrite par le CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) et l’EUCAST. L’épaisseur de la gélose (4 mm) et la concentration en cations (Ca²⁺, Mg²⁺) sont cruciales pour la diffusion des antibiotiques. Une couche de 4 mm est obtenue avec 25 mL de milieu dans une boîte de 90 mm.

Gélose Sabouraud

Additionnée d’antibiotiques (comme le chloramphénicol ou la gentamicine), elle est sélective pour l’isolement des champignons microscopiques, des levures (Candida) et des moisissures. Son pH est acide (5,6), ce qui inhibe la plupart des bactéries.

• Sans antibiotique : milieu non sélectif pour les champignons.

• Avec antibiotiques (Sabouraud + Chloramphénicol) : élimine les bactéries contaminantes.

• Parfois additionnée de cycloheximide (actidione) pour inhiber les moisissures et favoriser les levures pathogènes.

Notes de l’IA 🧑‍🏫 : Le milieu Sabouraud a été développé par le dermatologue français Raymond Sabouraud en 1890. Sa composition classique est : peptone (10 g/L), glucose (40 g/L), agar (15 g/L). Le pH acide et la forte concentration en sucres favorisent la croissance fongique. Le chloramphénicol est ajouté après autoclavage pour ne pas être dégradé par la chaleur.

Points Clés à Retenir 📌

• La gélose Mueller-Hinton est le référence pour les tests de sensibilité aux antibiotiques.

• La gélose Sabouraud, à pH acide, est le milieu de choix pour l’isolement des champignons.

• Les additifs (antibiotiques, cycloheximide) améliorent la sélectivité selon l’usage.